v. 1.3 VIRUS-HIV1-RNA. RealTime PCR

ANALYSE

Abbott Real Time HIV-1

PRODUSENT/LEVERANDØR

Abbott Molecular

ANSVAR

Fagleder er teknisk ansvarlig for analysen og instrumentene (m2000sp og m2000RT). Fagleder er også ansvarlig for bestilling av varer.

Ansvarlig lege har det medisinsk faglige ansvar for analysen og godkjenning av resultatene.

PRINSIPP

Samme prinsipp som for HCV-RNA.

Se Ugyldig lenke og Ugyldig lenke

Målsekvensen for HIV-1-analysen (Abbott Real Time) finnes i pol integrase-regionen av HIV-1-genomet. Dette er en stabil region og primerene er utformet for å hybridisere til denne regionen. Fordi dette er en stabil region vil risikoen for feilmatchinger mellom ulike subtyper være lavest her.

Internkontrollens målsekvens er hentet fra hydroxypyruvatreduktase-genet i gresskarplanten og er fortynnet i negativt human plasma.

HIV-1 proben har en fluorescerende del som er kovalent bunden til 5`-enden. En kort oligonukleotid (demperoligonukleotid) sitter ved 5`-enden av HIV-1-proben og har en dempermolekyl (quencher) ved 3`-enden.

Når HIV-1 ikke er tilstede i prøven dempes HIV-1-probens fluorescens gjennom hybridisering til demperoligonukleotiden.

Ved HIV-1 (målsekvens) tilstede i prøven vil HIV-1-proben foretrekke å hybridisere til målsekvensen og separere denne fra demperoligonukleotiden. Dette muliggjør deteksjon av fluorescensen.

De HIV-1-og internkontroll-spesifikke probene er merket med ulike fluoroforer. Dette gjør det mulig å samtidig påvise begge de amplifiserte produktene under hver syklus. Amplifiseringssyklusen hvor de fluoriserende signalene påvises er proporsjonal med HIV-1-RNA-virusets logkonsentrasjon i den opprinnelige prøven.

PRØVEMATERIALE

Ekstrahert materiale fra m2000sp, prosedyreUgyldig lenke

Det skal kjøres PCR umiddelbart etter mastermix-pipettering.

HMS

Både prøver, kontroller og kalibratorer behandles som infeksiøst materiale.

Vi bruker pipettespisser med aerosolbarriere.

Prøvepreparering, reagenstillagning og amplifisering holdes adskilt.

Bruk alltid hansker både på prøver og reagenser.

REAGENSER

Abbott RealTime HIV Amplification Reagent Kit

1). INTERNAL CONTROL : RNA med interne kontrollsekvenser i negativt human plasma.

2). AMPLIFICATION REAGENT PACK :  Abbott RealTime amplifiserings-reagens kit.

-termostabilt rTth-polymerasenzym i bufferløsning.

-HIV-1-oligonukleotidreagens. < 0,1% syntetiske oligonukleotider ( 4 primere, 2 prober og en demperoligonukleotid)    og < 0,3% dNTPs i en bufferløsning med referansefarge.

-aktiveringsreagens. 30 mmol/L mangankloridløsning.

Oppbevares i fryser på rom 157F. Kan tines og brukes to ganger. Settes tilbake i fryser så snart som mulig. Holdbar ei uke etter blanding (1. gangs bruk).

Nytt, ikke blandet reagens, tas ut til tining 1,5 time før bruk. Ferdig blandet reagens (2.gangs bruk) tas ut 20 min. før bruk.

NB! Amplifeseringsreagenset tines i kjøleskap, internkontroll kan tines på benk.

 

Abbott RealTime HIV Control Kit

1). CONTROL - : Abbott RealTime HIV-1 negativ kontroll. Negativt human plasma

2). CONTROL L : Abbott RealTime HIV-1 lav positiv kontroll. Ikke smittefarlig RNA med HIV1-sekvenser i negativ human plasma.

3). CONTROL H : Abbott RealTime HIV-1 høy positiv kontroll. Ikke smittefarlig RNA med HIV-1-sekvenser i negativt human plasma.

Oppbevares i fryser på rom 157F, holdbar i 6 timer etter tining. Kan tines på benk.

Abbott RealTime HIV Calibrator Kit

1). CAL A : Abbott RealTime HIV-1 kalibrator A. Ikke smittefarlig RNA med HIV-1-sekvenser i negativt human plasma.

2). CAL B : Abbott RealTime HIV-1 kalibrator B. Ikke smittefarlig RNA med HIV-1-sekvenser i negativt human plasma.

Oppbevares i fryser på rom 157F, holdbar i 6 timer etter tining. Kan tines på benk.

UTSTYR

m2000RT

UTFØRELSE

VIRUS-HIV1-RNA RealTime PCR utføres en gang pr. uke (etter avtale med Medisinsk poliklinikk, SUS).

Ekstraksjon utføres på m2000sp etter prosedyre  Ugyldig lenke, RNA-ekstraksjon. Bruk protokollen "0,6 ml HIV-1 HCV RNA version 4.0 maxCycle 0,6 ml HIV-1 HCV combined 96 samples"

Mastermix pipettering utføres i et eget step på m2000sp. Ferdig blandet mastermix er holdbar ei uke, og kan brukes 2 ganger på m2000sp.

Informasjon fra ekstraksjonen overføres elektronisk fra m2000sp til m2000RT hvor PCR kjøres. Se prosedyre Ugyldig lenke 

Dersom informasjon ikke blir automatisk overført fra m2000sp til m2000RT må informasjonen legges inn manuelt i RT. Se prosedyre Ugyldig lenke NB! Husk å bruke protokollen "0,6 ml HIV-1 HCV RNA version 4.0 maxCycle 0,6 ml HIV-1 HCV combined 96 samples" også i RT.

KVALITETSKONTROLLER

Kontroller og kalibratorer; se under REAGENSER.

Se også prosedyre for  Kit-uavhengige kontroller for PCR-analyser Ugyldig lenke

Kit-avhengige kontroller skal være innenfor oppgitte verdier (ligger i instrumentet).

I tillegg brukes også en kit-uavhengig (ekstern) kontroll som er en fortynnet pasient-prøve. Kit-uavhengig kontroll skal være med på hvert oppsett som en pasientprøve.                                                  

Kontrollen hentes inn i LIS sammen med prøvene. Dersom kontrollen blir merket med rødt i LIS ligger den utenfor det oppgitte måleområdet. Kontrollverdier innenfor 2 SD godkjennes uten videre. Verdier innen for 3SD kan også godkjennes, men må følges overtid (sjekk på «full plot»). Legg inn kommentar på kontrollen ved å gå inn på resultatregistrering og klikk "Ctrl.F7"

Se også prosedyre for kit-uavhengige kontroller:

  Ugyldig lenke
   

Ved kontrollverdier utenfor 3SD eller ved manglende kontrollverdi skal oppsettet kjøres om.

Kontrollverdiene overføres og resultatene (de 30 siste) oppbevares i LIS.

Noen kontrollresultater oppbevares også skriftlig i egen perm merket "Kontroller" på rom 167F.

Internkontrollene (IC) skal være innenfor oppgitte verdier (ligger i instrumentet).

Analyserer SLP fra QCMD 1-2 ganger i året se  Ugyldig lenke

AVVIK

Ved avvik på kontrollene skal fagleder/seksjonsleder varsles. Prøvene må evt. analyseres på ny. Ved omkjøring skal det meldes i synergi Ugyldig lenke

TOLKNING AV RESULTATENE

Not detected: Ikke påvist.

<40 IU/ml detected: Påvist.

>40 IU/ml: Påvist

Måleusikkerhet

Måleusikkerheten for de siste 30 kjøringer vurderes ut fra kit-uavhengig kontroll i LIS.

Utskrift av verdier og plot på kit-uavhengig ktr. finnes i perm for prosedyrer på rom 157A.

Se også Måleusikkerhet - mikrobiologiske analyser og Ugyldig lenke  

BESVARELSE

Prøvene besvares i LIS.

Gå inn på Teknisk godkjenning/Arbeidsliste og velg

-stasjon: M2000RT

-instrument: M2000RT

Lag ny batch dersom det ikke er gjort den dagen.

Klikk Ctrl. og F9 for å hente inn resultatene.

 

Resultatene gis ut i kopier/ml. Bruk mellomrom for hvert 3. siffer. F.eks. 100 000

Ved to positive PCR-resultater på en pasient skal dette meldes anonymt dersom det ikke er gjort før. NB! Legg inn nr. på meldeskjema og bruk kommentaren MSIS-HIV: "Funnet er anonymt meldepliktig til MSIS. Laboratoriemelding er sendt. Rekvirent må fylle ut og sende inn originalt nummerert meldeskjema ...... som følger svarrapport".

Bruk avrunding etter følgende kriterier:

For verdier > 10 000 000; gi ut > 10 000 000.

For verdier > 1 000 000 og < 10 000 000; rund av til nærmeste 100 000.

For verdier > 100 000 og < 1 000 000; rund av til nærmeste 10 000.

For verdier > 10 000 og < 100 000; rund av til nærmeste hele 1 000.

For verdier > 1000 og < 10 000; rund av til nærmeste hele 100.

For verdier <1000; skriv hele tallet.

Dersom resultatet avrundes og endres, skal råverdien kopieres (ctrl D) og limes inn i kommentarfeltet på analyselinjen.

Resultater med «Påvist» blir medisinsk godkjent.

OPPBEVARING/ARKIVERING

Prøvene kastes etter kjøring. 1 ml plasma er arkivert i frysearkiv.

REFERANSER

-pakningsvedlegg; «Abbott RealTime HIV-1»